图：Euan Ashley教授及同事，来源：斯坦福大学
基因组测序技术的临床应用使科学家能够分析患者的完整基因组信息，这对于遗传病以及罕见遗传病的诊断至关重要，因为一旦医生发现了导致疾病的特定基因突变，就可以相应地调整治疗方案。基因诊断可以指导临床决策，改善患者预后，并降低危重患者的成本。
虽然基因组测序技术已经得到了突飞猛进的革新，但目前的传统基因检测获得分析结果的周期相对较长，即使快速检测也仍然需要数天时间，这对大多数重症监护决策必须在数小时内做出显然是不友好的。近日，斯坦福医学院Euan Ashley教授研究团队及合作者在国际顶尖医学期刊The New England Journal of Medicine发表了题为“Ultrarapid Nanopore Genome Sequencing in a Critical Care Setting”的文章。研究团队通过结合商业纳米孔基因组测序的简化流程、基于云的分布式生物信息学和自定义变体优先级方法而开发的超快速基因组测序方法，可以准确快速地提供基因诊断。真实世界案例数据分析表明，这种新的超快速基因组测序方法能够在平均8小时内诊断出罕见的遗传疾病！这在标准临床决策中几乎是闻所未闻的“超高速”。
文章发表在NEJM
在2020年12月至2021年5月期间，研究团队在斯坦福的两家医院招募了12名疑为遗传病的危重患者，这些患者在种族、民族和性别方面普遍代表了居住在美国的人群。研究团队利用新开发的超快速基因测序方法对其中5名患者进行初步基因诊断发现，从血液样本到达实验室到得到初步诊断的最短时间为7小时18分钟。其中一个患者的基因组测序仅花费了5小时2分钟，这创下了最快的DNA测序技术的吉尼斯世界纪录，该记录被美国国家科学技术研究所认证，并被吉尼斯世界纪录收录。
这种快速的基因诊断意味着患者可以在重症监护病房花费更少的时间，以及需要更少的其他检测，可以更快地进行靶向治疗。值得注意的是，这项更快的基因测序方法并没有牺牲准确性。据报道，长读长测序技术——纳米孔基因组测序在这项快速诊断策略中发挥了重要作用。传统的基因组测序技术是将基因组打断为小片段，然后使用标准人类基因组作为参考，将所有测序得到的reads拼凑在一起。但这种方法并不总能捕获完整的基因组，且提供的信息有时会漏掉具有指导诊断的基因变异。长读长测序技术可以克服上述难题，保留由数万个碱基对组成的长片段DNA，为科学家在基因组序列中寻找变异提供了准确性更高的信息和更多细节。该研究中，超过一半的测序片段超过25kb。每一个基因组能产生173~236Gb的数据，序列比对一致性达94%，常染色体的覆盖率达到46~64x。文章通讯作者Euan A. Ashley表示：“使用长读长测序更容易检测到发生在大部分基因组上的突变。如果没有长读长测序方法，部分变异几乎不可能被检测到，这也是我们采用这种方法的重要原因之一。”与此同时，基因测序技术公司的持续研发也使得长读长测序方法的准确性逐步改善，高昂的测序价格也在逐渐下降，因此该技术可以用于临床诊断。这项发表在NEJM的最新研究也首次证明了长读长测序作为医学诊断主要手段的可行性。为了实现超快的测序速度，毋庸置疑，研究人员需要新的硬件设施。研究人员选择了Oxford Nanopore Technologies公司的PromethION 48测序平台，可以使所有flow cell同时对一个人的基因组进行测序。同时，生物信息学分析框架也进行了更新。通过改进数据分析流程和数据存储系统，以允许将TB级别的原始测序数据直接输送到云存储系统，并将数据分布在多台云计算机上进行分析。该系统计算能力可以被放大到足以实时筛选数据，实现近乎实时的测序数据检出和基因组比对分析，将测序后的分析时间减少了93%。具体而言，从此前的7小时21分钟减少到34分钟。最后，研究人员将患者的基因变异信息与已知可导致疾病的基因变异进行比较，以寻找可能导致疾病的基因组错误。结合测序分析结果，临床医生可立即审查所有的临床检测结果，并就分析得到的基因组变异是否代表患者就诊的主要原因达成共识。
图1. 超快速基因组测序平台流程示意图，来源：NEJM
在纳入研究队列的12名疑为遗传病的危重患者中，有5名发现了具有诊断价值的基因组变异，患者的年龄从3个月到57岁不等。这些发现立即得到了临床实验室改进修正案流程认证的实验室的确认，并为5名患者或其家庭成员提供了知情的临床管理（包括交感神经切除术、心脏移植、筛查和药物变化）。
一位13岁的患者，因剧烈咳嗽和高烧来到当地医院，随后发生了心脏衰竭，医生建议患者立即飞往斯坦福医院接受治疗。之后，患者的病情持续恶化，并靠呼吸机维持生命。Ashley教授表示：“健康的13岁儿童经历这种心力衰竭可能有两个原因。一种被称为心肌炎，它发生在免疫细胞涌入心脏时，通常由病毒或其他身体压力引发；另一个是遗传原因，涉及心脏功能的基因突变。但两者具有本质的区别，心肌炎通常是可逆的，通过治疗，心脏可以恢复正常；但遗传性心肌炎则不行。如果该患者是遗传性的，可能唯一的解决方案就是心脏移植。”随后，经过监护人的同意，医院对该患者进行了快速基因组测序研究。几个小时后，测序数据显示该患者属于遗传性心肌炎。随后患者立即被列入心脏移植名单，进行了心脏移植。一年后，患者已经基本恢复，状态良好。在另一个案例中，一名3个月大的患者因不明原因的癫痫发作来到斯坦福医院儿科急诊。很明显，婴儿患有某种形式的癫痫症，但究竟是什么导致了这些症状尚不清楚。随后，研究人员对患者的基因组进行了测序，通过突变检测算法对测序数据进行分析，并与公共基因组和疾病数据库进行关联分析；同时，还对与遗传性癫痫发作相关的血液生物标志物进行标准临床诊断检测。得益于快速的测序数据分析，仅8个多小时后，就发现这名患儿的抽搐是由一种名为CSNK2B的基因突变引起的。这一诊断决策停止了医生们对其进行进一步诊断检测的做法，并加强了针对该疾病的咨询和预测，通过分析癫痫发作类型和对常见抗癫痫药物治疗反应的关联来帮助该癫痫患儿的临床管理。Ashley介绍说，如果只依赖标准测试策略，那么当时医生就不会快速做出任何诊断，虽然进一步的检测最终可能会为患者做出正确的诊断，但可能需要挣扎好几个星期。
图2. 快速基因组测序平台性能汇总，来源：NEJM
目前的标准检测筛查仅局限于疾病相关的特定生物标志物，且检测速度较慢，这意味着可能需要很长时间才能将新发现的致病突变用于临床决策中，这可能导致病情延误和漏诊。因此，快速基因组测序对于患有罕见遗传病的患者来说可能会改变目前既定的临床诊断规则。我们可以通过扫描患者的整个基因组，寻找科学文献中提出的任何相关基因变异。此外，如果患者最初没有接受基因诊断，我们仍有希望找到与患者疾病相关的新基因变异。该研究团队试图加快对患者基因组测序的各个方面。研究人员研发新平台以支持同时进行的基因组测序，并提高计算能力以有效处理海量数据集。目前，该团队正在优化该系统以进一步缩短时间。Ashley表示：“未来，我认为我们可以再次将时间减半。如果能够做到这一点，我们则能够在医院查房结束之前就得到答案，这将是一个巨大的飞跃。”参考资料：
1. Gorzynski JE et al. Ultrarapid Nanopore Genome Sequencing in a Critical Care Setting. N Engl J Med. 2022 Jan 12. doi: 10.1056/NEJMc2112090.
2. Dimmock D, et al. Rapid precision care incorporating rWGS in 5 California children’s hospitals demonstrates improved clinical outcomes and reduced costs of care. Am J Hum Genet 2021; 108: 1231-8.
3. Shafin K, et al. Haplotype-aware variant calling with PEPPER-Margin-DeepVariant enables high accuracy in nanopore long-reads. Nat Methods 2021; 18: 1322.
4.Fastest DNA sequencing technique helps undiagnosed patients find answers in mere hours
https://med.stanford.edu/news/all-news/2022/01/dna-sequencing-technique.html
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